미생물 시험(BI Test, 바이오버든, 무균 시험, 엔도톡신)에 대하여 (feat. 4등급 의료기기(필러) 위주)

 
이번에 공부할 내용은 미생물 시험에 대한 내용이다.
 
4등급 의료기기 필러 기준 자주 접하게 되는 미생물 시험은 B.I Test, 바이오버든, 무균 시험, 엔도톡신이 있다.
 
각 시험에 대해 간단히 알아보고, 마지막에 위 시험들끼리 비교 해보자.
 

 B.I(BIological Indicator) Test
생물학적 지표 시험

개요

 생물학적 지표로 멸균 공정의 유효성을 평가하는 시험으로, 특정 멸균 방법에 저항성을 가진 포자를 포함한 생물학적 지표(BI)를 사용한다.

* 멸균 방법별 포함된 포자
Geobacillus stearothermophilus 포자 : 습열(증기) 멸균
Bacillus atrophaeus 포자 : 건열, EO 가스 멸균
Bacillues pumilus 포자 : 감마 멸균 (전자빔 멸균 : ISO 11138에서 언급X)

목적

1. 멸균 공정의 유효성 확인
: 제품과 동시에 멸균하여 멸균 여부 확인

2. 일상적 멸균 공정 모니터링

3. 신규 멸균기 도입 시 검증

4. 멸균 조건 변경 시 검증

시험 시점 및 측정 대상

시험 시점: 멸균 공정 수행 시

측정 대상: 멸균 공정에 대한 저항성이 있는 미생물 포자의 사멸 여부

필요 기자재

1. BI (Biological Indicator)

2. 인큐베이터 
: 멸균된 BI 배양

3. 클린벤치, 멸균수 또는 배지, 멸균 장갑
: BI 구입해서 시험할 경우 필요X

시험법

1. BI 선택
: 멸균 방식, BI 포자 수, 저항성 등을 확인

2. BI 배치
: 멸균기 내부에 BI 배치, 멸균기 내부에서 멸균 조건에 도달하기 어려운 곳(Worst case)와 멸균 부하 지점 선정

3. 멸균
: 멸균 공정 실시

4. BI 회수
: 회수

5. BI 배양
: BI에 맞는 온도 및 시간으로 배양

6. 결과 판독
: 색상 변화로 결과를 판독, 양성: 색상 변화 있음 / 음성: 색상 변화 없음  :: 멸균되지 않은 BI(대조군)을 함께 배양하여 결과에 대한 유효성을 부여

규정

1. ISO 11138 Series 
: BI 선택에 대한 요구 사항

2. ISO 11135 
: EO 가스 멸균에 대한 기준

3. ISO 11137 
:방사선 멸균에 대한 기준

4. ISO 17665
: 습열 멸균에 대한 기준

비고

BI를 판매하는 회사들마다 배양해야하는 온도와 시간이 다르다. 사용하려는 BI마다의 배양 온도와 시간을 확인해야 한다.

BI는 멸균 공정의 유효성 확인용으로 무균 시험과 목적이 다르다.

감마 멸균하는 제품의 경우, BI Test 없이 바이오버든 시험으로 멸균 밸리데이션을 진행하는 경우도 있다.

Bioburden
바이오버든

개요

제품에 존재하는 총 살아있는 미생물의 수를 확인하는 시험

목적

1. 원자재 및 제품의 미생물 오염 수준 모니터링

2. 멸균 공정 설계 시 초기 미생물 오염 수준 파악 및 조건 설정

3. 멸균 공정의 유효성 검증

4. 제조 공정 중 청정도 평가

시험 시점 및 측정 대상

시험 시점: 공정 중 또는 멸균 전

측정 대상: 총 살아 있는 미생물 수 (세균, 효모, 곰팡이 등)

필요 기자재

1. 클린벤치
: 시험 과정 중 오염 방지

2. 배양기
: 미생물 배양

3. 배지 (Tryptic Soy Agar(TSA), Sabouraud Dextrose Agar(SDA))
: TSA: 총 호기성 세균, SDA: 진균

4. 막 여과 장치
: 액체 시료에서 미생물을 회수하는 데 사용

시험법

1. 시료 준비
: 시험 대상 채취, 미생물 회수를 위한 제품 액체화

2. 미생물 회수
: 준비된 시료 용액에서 필터법 또는 평판 계수법 등의 방법으로 미생물 분리

3. 배양
: 분리된 미생물을 적절한 배지에 접종하고 온도와 시간을 맞춰 배양

4. 계수
: 배양 후 배지에 형성된 콜로니 수를 세어 총 미생물 수 산출 (결과는 CFU/g, CFU/ml, CFU/unit)

규정

ISO 11737-1, 2 (바이오버든 측정 및 멸균 공정 관련 기준)

비고

PLLA 필러는 멸균 공정 밸리데이션이나 특이 사항 발생 시에만 시험 진행해도 무방해보인다.

 

Sterilization Test
무균 시험

 

개요

멸균된 최종 제품의 무균성을 확인하는 시험으로, 모든 종류의 균 존재 여부를 평가

목적

1. 제품의 무균성 확인

2. 규제 기관 요구사항 충족

3. 멸균 공정 유효성 검증

4. 제품 품질 관리

시험 시점 및 측정 대상

1. 시험 시점: 공정 완료 후 매 배치

2. 측정 대상: 모든 살아있는 미생물 (세균, 진균 등)의 생존 여부

필요 기자재

1. 클린벤치
: 시료 채취 등 과정에서의 오염 방지

2. 배양기
: 시료 배양

3. 배지 (FTM(액상티오글리콜산), TSB(대두카제인 소화배지))
: FTM: 혐기성 세균(호기성도 가능), TSB: 호시겅 세균 및 진균

시험법

직접법과 간접법이 있지만 공통적으로 들어가는 부분만 정리하면 아래와 같다.
*직접법: 간편하나, 탁한 검체에 적용이 어려움
** 간접법: 여과 과정이 필요하나, 탁한 검체에 적용 가능

1. 시료 준비
: 샘플을 무균적인 방법으로 채취

2. 접종
: 채취한 샘플을 배지에 접종

3. 배양
: 배지 배양

4. 관찰
: 배양 기간 동안 배지에서의 미생물 성장을 관찰

규정

대한민국약전 - 일반시험법 - 무균시험법

USP, EP 무균시험법

비고

4등급 의료기기의 경우 매 생산 배치마다 무균 시험 진행 필수

Endotoxin
엔도톡신

개요

제품 내 그람 음성균의 내독소(Endotoxin) 존재 유무 및 양 측정
엔도톡신은 투구게의 혈구추충성분인 LAL(Limulus Amoebocyte Lystate)과 반응하는 특징이 있다. 이 특징을 이용하여 LAL의 반응에 의해 발색기질을 유발하게 하여 발색물질의 양을 측정한다.

목적

1. 제품 안전성 확보

2. 규제 기관 요구사항 충족

3. 제조 공정 관리

4. 제품 품질 관리

시험 시점 및 측정 대상

시험 시점: 원자재 입고, 생산 완료된 모든 배치, 멸균 밸리데이션 등

측정 대상: 내독소 (세균이 죽으면서 방출하는 독성 물질)

필요 기자재

1. 엔도톡신 측정 장비 (비색법, 탁도법, 형광법 등)

2. 엔도톡신 시험 키트 (LAL 시약 포함)

시험법

1. 시료 준비
2. 표준액 준비
3. 시험 수행
4. 결과 판정
: 필러의 경우: 0.5 EU/device 미만이지만, 제품마다 허용 기준이 다를 수 있다. (의약품의 엔도톡신 기준 설정법 확인 필요)
희석 배수에 따라 허용 기준 달라질 수 있다.

규정

1. 대한민국약전 - 일반 시험법 - 엔도톡신 시험

2. USP, EP 엔도톡신 시험법

3. ISO 10993-11 (독성 평가 관련)
: 엔도톡신에 대한 구체적인 시험법이나 언급은 없지만, 독성 평가에 엔도톡신이 적용될 수 있다는 점을 시사하고 있다.

비고

허용 기준은 아래와 같다.  
1. 주사제의 경우 0.25 EU/mL 이하
2. 의료기기의 경우 0.5 EU/device 이하
* 필러의 경우 0.5 EU/device 이하이나, 제품마다 허용 기준이 다를 수 있음
**희석 배수에 따라 허용 기준이 달라질 수 있으므로 제품별 기준 확인 필요

매 생산되는 배치마다 엔도톡신 시험을 진행하는 것을 권장한다.

---

총 정리

시험명	무엇을 검사?	언제 시행?	왜 필요?
BI 시험	필러 멸균이 제대로 되는지 확인하기 위해 멸균기 내부에서 살아남을 가능성이 높은 미생물 포자의 생존여부를 검사	멸균 공정 밸리데이션 시 (처음 공정 설정 시) 정기적 멸균 공정 검증	멸균 공정이 제대로 작동하는지 확인
바이오버든 (미생물 오염도)	멸균 전 필러에 존재하는 살아있는 미생물(세균, 곰팡이...)의 수를 측정	공정 중 (멸균 전,원자재 및 반제품 단계)	원자재나 제조 공정 중 오염 수준을 모니터링
무균 시험	멸균이 완료된 최종 제품이 완전히 무균 상태인지 확인	생산 완료된 모든 배치를 검사	최종 제품이 완전한 무균 상태인지 보증
엔도톡신 시험 (내독소 검사)	원자재나 제품에 그람 음성균이 만든 독소(엔도톡신)가 존재하는지 검사	원자재나 반제품, 완제품을 검사	체내 주입 시 발열 반응을 방지하기 위해 필요

 
 다시 정리하면
 BI 시험: 멸균 공정이 제대로 작동하는지 확인 (멸균기 안에서 테스트)
 바이오버든 시험: 멸균 전에 제품에 오염된 미생물 수를 측정
 무균 시험: 멸균 후 최종 제품이 완전히 무균인지 확인
 엔도톡신 시험: 제품에 발열을 유발할 수 있는 내독소가 없는지 확인

 쉽게 말해, 바이오버든과 무균 시험은 "미생물이 있는지", 엔도톡신 시험은 "독소가 있는지", BI 시험은 "멸균이 잘 되었는지" 확인하는 시험이다.
 
 각 시험은 외주를 맡기지 않는 이상 SOP를 작성하여 관리하여야 한다. 지금까지는 시험법에 대한 밸리데이션을 확인하지 않았었다는데, CE MDR부터 시험법 밸리데이션도 확인한다고 한다. 미리 공부해서 자료를 준비해놓는 것도 좋을 것 같다.
 
 
근무하면서 여러번 들었던 시험들인데, 제대로 정리한 적이 없었던 것 같아서 정리해보았다.
 
새롭게 진행되는 시험들에 대한 정보들도 정리해놓아야겠다는 생각이 든다. 
 
끝!